1 ~ 3 차원 마우스의 풀 스킨 익 제를 제조 하 고 이전에 상세한 방법을 따라 배양 하였다 (전 2002). 간단히 말해서, 새끼는 70% 에탄올에 decapitated 고 담가 주었다. 조직 배양 후드에서, 사지를 제거 하 고, 피부를 하 부 하 고 6 웰 조직 배양 판 (코 닝)에 표 피 측을 내려 두었다. 스킨은 ImageXpress 벨로 스 스캐닝 사이토 미터를 사용 하 여 GFP 및 RFP를 스캔 하 고 ImageXpress 벨로 s 소프트웨어 (분자 장치)로 시각화 되었습니다. 피부의 이중 EGFP 및 DsRed 포지티브 섹션은 3mm 생 검 펀치를 사용 하 여 제거 하 고 24 웰 조직 배양 플레이트에 진 피 쪽을 내려 두었다. 익 제는 5 ~ 10 분 동안 조직 배양 플레이트를 부착 하도록 허용 하였으며, 그 후에는 200 μ l의 익 제 배지를 첨가 하였다. 설명 배지는 앞서 기술 된 바와 같이 제조 하였다 (2002 외. 익는 5% CO2로 37°c에서 밤새 인큐베이션 하였다. 다음날, 익 제는 각 웰에 800 μ l의 매체를 추가 하 여 침수 시켰다.

이미지는 매일 캡처되며 미디어는 2 – 3 d 마다 교체 되었습니다. 각 질 세포의 적절 한 포커 싱을 위해 2 일째에 이미징이 시작 되었으며, 카 르 자이 터 카메라를 장착 한 Zeiss AxioVert 200 M 현미경에서 타임 랩 스 이미지는 매 시간 마다 3d(73 h) 동안 촬영 되었습니다. 타임 랩 스 설정은 Metamorph 소프트웨어 (버전 7.7.5)에 의해 제어 되었다. 이미지가 컴파일 되었고, 영화는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 만들어졌습니다. 미토마이신 C로 치료 하기 위해, 익 제는 미토마이신 C의 첨가 전에 ∼ 16 시간 동안 부착 하 고 성장할 수 있었다. 미토마이신 C 또는 매체 단독의 존재 하에서 2 시간 배양 한 후에, 익 스 테 인 배지로 세척 하 고, FGF 또는 FGF (10nm) 중 어느 하나를 포함 하는 매체 또는 매체로 배양 하였다. 이미지는 40 × 총 배율로 5 d 후에 캡쳐 되었으며, 각 각을 둘러싼 각 질은 ImageJ를 사용 하 여 정량화 되었다. 항-E-cadherin 및 Alexafluor 647 공액 항-phalloidin을 사용한 면역 형광 염색은 NMuMG 세포에 대해 전술 된 항 체 및 조건으로 수행 되었다. 안티 마우스 Alexafluor 647 공액 2 차 항 체 (1:2000)를 사용 하 여 전자-cadherin을 검출 하였다.

이미지는 설명 된 대로 200 × 배율로 캡쳐 되었습니다. NMuMG-pGIIIcI2 세포는 면역 형광 이미징에 대 한 폴 리 라이 신 코팅 된 35 mm 유리 바닥 접시 (MatTek Corp)에 씨를 주었다. 7 d 후, 세포를 15 분 동안 4% 파라 포름알데히드를 15 분 동안 0.2%의 트리톤 X-100을 함유 하는 PBS로 투과 하 여 고정 시켰다. 세포는 Zenon 알 렉 사 플 라 나 555-nm의 1 차 항 체 라벨링 키트 (인 비 트로 겐)를 사용 하 여 안티 E-카 데로 염색 하였다 안티 E-카 데 인 (BD 바이오 사이언스)의 μ g. 액 틴는로 다 민 공액 phalloidin (인 비 트로 1:40 겐)로 염색 되었고 15 분간 PBS에 희석 하였다. 모든 핵은 15 분 동안 1:2000 알 드 리치로 염색 되었다. 형광 이미지는 위에서 설명한 현미경 및 카메라를 사용 하 여 오일 침 지 하에서 600 × 배율로 촬영 하였다. 형광 기반 접합 기자는 상피-중간 엽 전환 (EMT) 시험관에서 표시. (A) 정상 마우스 유 방 (NMuMG) pGIIIcI2로 안정적으로 형질 감염 된 세포는 7 d에 대 한 TGF 또는 비 히 클의 존재 하에서 배양 하였다. TGF의 첨가는 EGFP 식 (이미지의 두 번째 열)의 현저한 감소를 초래 하 고 EGFP의 손실은 액 틴 응력 섬유 (세 번째 열, 상위 2 개 행) 및 전자 cadherin의 하향 조절 (세 번째 열, 아래 두 행)의 형성. (B) NMuMGs는 유 세포 분석기에 의해 추정 되는 바와 같이 거의 삼중으로 배양 한 후에 EGFP 발현을 감소 시켰다. 대체 접합은 단백질 코딩 유전자의 제한 된 수에서 단백질 isoforms의 광대 한 다양성을 생성 합니다, 독특한을 가진 isoforms의 많은, 그리고 심지어 대조, 기능.

형광 기반 접합 기자는 단일 세포 수준에서 대체 접합의 연구를 용이 하 게 할 가능성이 있으며, 거의 실시간으로 표현 형 전환에 대 한 유용한 정보를 제공 할 수 있다. 섬유 모 세포 성장 인자 수용 체 2 (FGFR2) 프리 mRNA는 대안적으로 상피 특이 적 및 중간 엽-특이 적인 IIIb 및 Iiib이 소 형태를 형성 하는 것으로, 각각은 유용한 마커 인 간 엽 전이 (EMT) 이다.